Badanie wpływu ekstraktów z kory brzozy wzbogaconej betuliną na ludzkie komórki nowotworowe

Tło

Pentacykliczne triterpeny, głównie betulina i kwas betulinowy, to cenne środki przeciwnowotworowe występujące w korze brzozy. W pracy oceniano ekstrakty z kory brzozy pod kątem składu składników aktywnych.

Wyniki

Zastosowano nowe, ulepszone metody ekstrakcji kory Betula pendula w celu uzyskania maksymalnej zawartości składników aktywnych. Ekstrakty analizowano za pomocą HPLC-MS, Ramana, SERS i spektroskopii ^13C NMR, które wykazały bardzo wysoką wydajność betuliny (ponad 90%). Działanie hamujące wzrost mierzono in vitro na czterech złośliwych ludzkich liniach komórkowych: A431 (rak naskórkowy skóry), A2780 (rak jajnika), HeLa (gruczolakorak szyjki macicy) i MCF7 (gruczolakorak piersi), za pomocą testu MTT. Wszystkie przygotowane ekstrakty z kory wykazywały wyraźne działanie antyproliferacyjne przeciwko ludzkim liniom komórek nowotworowych. Badania in vivo dotyczyły przeciwzapalnego działania ekstraktów z brzozy na indukowany TPA model zapalenia u myszy.

Wnioski

Badania wykazały skuteczność zabiegów ekstrakcyjnych oraz działanie antyproliferacyjne i przeciwzapalne ekstraktów z brzozy.

Pentacykliczne triterpeny to klasa związków szeroko badana jako przyszłe środki przeciwnowotworowe. Jedną z najczęściej badanych substancji z tej klasy jest kwas betulinowy (BA), którego skuteczność przeciwnowotworową zmniejsza jego słaba rozpuszczalność w wodzie [ ]. Dlatego też włożono wiele wysiłku w przezwyciężenie tej wady poprzez otrzymanie kompleksów z substancjami hydrofilowymi, takimi jak cyklodekstryny [ ] lub derywatyzację BA do związków bardziej rozpuszczalnych [ ].

Kwas betulinowy (ryc. a) występuje w wielu roślinach, zwłaszcza w Betula sp.; można go również otrzymać w drodze syntezy chemicznej z jej prekursora, betuliny (ryc. b), która występuje w tym samym gatunku [  ]. Procent substancji czynnych w korze brzozy różni się w zależności od gatunku; Przeprowadzono niewiele badań Betula pendula Roth, które można znaleźć w Rumunii, pod kątem zawartości betuliny/kwasu betulinowego w jej zewnętrznej korze.

Wzór strukturalny kwasu betuliny (a) i betuliny (b).

Obraz w pełnym rozmiarze

Brzoza znana jest od dawna ze swoich właściwości leczniczych; olej z kory brzozy stosowano w medycynie ludowej przy leczeniu chorób skóry (egzema, łuszczyca) [  ]. Wiadomo, że rdzenni Amerykanie używali kory do przygotowania herbat stosowanych w leczeniu infekcji przewodu pokarmowego [ ], dlatego oczekuje się, że wykorzystanie wyżej wymienionego gatunku jako surowca do ekstrakcji składników aktywnych mogłoby być ważnym źródłem związki do leczenia różnych patologii. Badania in vitro i in vivo wykazały indukujące interferon działanie zarówno suchego ekstraktu z kory brzozy, jak i betuliny [  ]. Betulina ma w swojej strukturze trzy pozycje aktywne, drugorzędową grupę hydroksylową przy C-3, pierwszorzędową grupę hydroksylową przy C-28 i podwójne wiązanie CC przy C-20, gdzie można przeprowadzać modulacje chemiczne w celu otrzymania różnego rodzaju pochodnych [  ] Poprzez utlenienie grupy hydroksylowej C-28 do karboksylu, betulina może zostać szybko przekształcona w jej bardziej aktywną pochodną, ​​kwas betulinowy, o szerokim spektrum działania biologicznego i farmakologicznego, takiego jak: przeciwzapalne, przeciwmalaryczne, przeciw wirusowi HIV, przeciwnowotworowe [ ].

Ostatnie badania wykazały możliwość uzyskania ekstraktu z zewnętrznej kory brzozy zawierającej ponad 70% betuliny [  ]. Nasza obecna praca łączy ekstrakcję rozpuszczalnikiem z procedurą ogrzewania w celu przygotowania osadu w oparciu o właściwości sublimacyjne betuliny [  ]. To połączenie procedur doprowadziło do zawartości betuliny w suchym ekstrakcie przekraczającej 90%.

Niniejszy raport stanowi kontynuację pracy zaprezentowanej wcześniej [  ] przez nasz zespół, w ramach projektu skupiającego się na znalezieniu nowych naturalnych źródeł przeciwnowotworowych, takich jak kora brzozy; jednocześnie nasz obecny raport przynosi ważne nowe dane badawcze. W unikalny sposób udoskonaliliśmy procedurę ekstrakcji betuliny i kwasu betulinowego z kory brzozy, uzyskując większą ilość substancji czynnej (ponad 90%) niż poprzednie badania. Wzbogaciliśmy także wiedzę na temat ekstraktu z kory brzozy pod kątem jego właściwości przeciwnowotworowych, analizując jego działanie na nowej linii komórkowej (A2780). Wszystkie elementy są nowe i stanowią krok naprzód w przedklinicznej ocenie tych ważnych związków przeciwnowotworowych.

W niniejszej analizie HPLC/MS oczekiwanym jonem, zgodnie z masą cząsteczkową betuliny (M = 442,3), byłby jej przewodnik protonowy, przy m/z 443,3. Wbrew oczekiwaniom jon ten nie został zauważony, ale większość jonów wykryto przy m/z 425,3, co odpowiada przewodowi utworzonemu z protonem przez odwodnioną cząsteczkę betuliny. Zasadniczo cząsteczka betuliny odwadnia się w temperaturze suszenia fazy ruchomej wewnątrz chromatografu (400°C) lub podczas jonizacji łukowej, po której następuje protonowanie. Czasy retencji wynosiły 2,75 minuty dla betuliny i 3 minuty dla kwasu betulinowego

Technikę HPLC stosowano wcześniej do ilościowego oznaczania pentacyklicznych triterpenów w ekstraktach naturalnych [  ]. W naszym poprzednim badaniu [ ] zastosowanie analizy HPLC/MS wykazało 57% procent betuliny i 3% kwasu betulinowego w korze brzozy Betula pendula Roth.

Donoszono o izolacji triterpenów z gatunków brzozy; kora brzozy ujawniła obecność triterpenowych pochodnych szkieletu lupanu, takich jak betulina i kwas betulinowy [  ]. Betulina jest występującym w dużych ilościach naturalnym triterpenem, a jej obecność w naturalnych źródłach sprawia, że ​​procedura ekstrakcji jest bardzo ważna w przypadku produkcji na dużą skalę. Procedury ekstrakcji są bardzo różne, od ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami [ ] po ekstrakcję dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym [ ].

Procent składników aktywnych w korze brzozy różni się w zależności od gatunku; Diouf i in. [  ] donieśli w 2009 r. o zawartości 56% betuliny w korze brzozy żółtej ( Betula alleghaniensis Britton ) w Quebecu w Kanadzie. Jäger i in. podali 34% zawartość betuliny. w 2008 r. [  ]. Jednakże przeprowadzono niewiele badań gatunku Betula pendula Roth pod kątem zawartości betuliny/kwasu betulinowego w korze zewnętrznej. Ekstrakcję betuliny można przeprowadzić stosując wysokowrzące rozpuszczalniki węglowodorowe lub wodne azeotropy alkoholi [ ].

W poprzednim badaniu [  ] do przygotowania betuliny zastosowaliśmy mieszaninę rozpuszczalników i ciągłą ekstrakcję Soxhleta, osiągając procentową zawartość substancji czynnej wynoszącą ponad 50%. W niniejszym artykule zastosowaliśmy dwa rozpuszczalniki organiczne, etanol i propanol, uzyskując znacznie lepsze wyniki, aż do 97% . Dzięki dużej zawartości betuliny ten gatunek brzozy doskonale nadaje się do przemysłowego wytwarzania betuliny i jej pochodnych.

^{Spektroskopia 13C} -NMR jest bardzo czułą techniką stosowaną do charakteryzowania betuliny. Dla całej przygotowanej próbki rejestrowano widma 13C-NMR w ^stanie stałym . Ze zintegrowanej analizy pików betuliny i rezonansów związków w zakresie 10–110 ppm można stwierdzić, że obecność betuliny w ekstraktach jest znacznie wyższa w porównaniu z wcześniej raportowanymi produktami [ 12 ] . Na podstawie tego doświadczenia nie udało się określić obecności kwasu betulinowego, co prowadzi do wniosku, że ilość kwasu betulinowego w ekstrakcie jest mniejsza niż 5%. Ponadto próbki 1 pp i 3 pp charakteryzują się wysokim stopniem krystaliczności ujawnionym przez kształty rezonansów NMR w stanie stałym.

Nasza grupa przeprowadziła pełną charakterystykę wibracyjną betuliny i wcześniej zaprezentowano kilka bezpośrednich zastosowań tej charakterystyki

Spektroskopia Ramana może dostarczyć półilościowych informacji dotyczących zawartości triterpenów w ekstraktach końcowych poprzez analizę stosunku intensywności względnej pasma 1642 cm ^-1 (tryb triterpenu C = C) i 1601 cm ^-1 , przypisanego innym organicznym związkom resztkowym z kora. Wykonując charakterystykę wibracyjną betuliny [ ], wykazaliśmy możliwość zastosowania spektroskopii Ramana do przewidywania najwyższej zawartości triterpenów w gatunkach kory, doboru odpowiedniego okresu zbioru lub do bezpośredniej selekcji w zakresie poszczególnych genotypów przy użyciu odpowiedniego przenośnego sprzętu Ramana .

Stosunek intensywności względnej pasma przy 1642 cm ^-1 reprezentatywnego dla triterpenów i pasma przy 1606 cm ^-1 przypisanego gatunkom innym niż triterpeny I ₁₆₄₂ / I ₁₆₀₆ wahał się od 0,9 do 1,1 w dziewięciu próbkach kory brzozy użytych do ekstrakcji protokół. Obecny stosunek intensywności tych pasm dla 1 pp i 3 pp wynosi odpowiednio 5,8 i 6,1 (dodatkowy plik  : rysunek S3), co wskazuje na wyższą czystość w porównaniu z wcześniej zgłoszonymi ekstraktami [  ].

Sygnał SERS ekstraktu wykazuje duże różnice w położeniu pasm i względnej intensywności w porównaniu z odpowiednim widmem Ramana ekstraktu stałego, potwierdzając chemisorpcję głównego gatunku w odniesieniu do powierzchni nanocząstek Ag. Najbardziej wzmocnione pasma zaobserwowano w zakresie widmowym 1400–1200 cm ^-1 , gdzie przypisane są mody rozciągania szkieletowej struktury drganiowej [  ]. Tryb wibracyjny przy 1642 cm ^-1 jest mniej wzmocniony, co wskazuje, że końcowa grupa funkcyjna –CH _2OH betuliny jest mniej zaangażowana w chemisorpcję na powierzchni nanocząstek Ag, a struktura betuliny przyjęła bardziej nachyloną orientację w stosunku do nanocząstek Ag . Przypuszczenie to potwierdza poszerzenie pasm SERS w porównaniu z pasmami Ramana (plik dodatkowy  : rysunek S4).

Spektroskopia Ramana wykazała, że ​​ekstrakty można scharakteryzować z dużą czułością, co pozwoliło na uwypuklenie wysokiej zawartości betuliny w ekstraktach stałych. Widma SERS wykazały bardzo dobrą powtarzalność i stabilność w czasie nawet po 48 godzinach od przygotowania próbki, a także dostępność do adsorpcji na powierzchni nanocząstek, a tym samym możliwość wykrycia śladowych ilości związku aktywnego w środowisku wodnym. Podsumowując, technika SERS umożliwiła wykrycie zaadsorbowanych gatunków z naturalnego ekstraktu w bardzo niskich stężeniach, zgodnych z wartościami fizjologicznymi. Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwszy raport SERS dotyczący zaadsorbowanej betuliny z ekstraktów naturalnych.

Wszystkie przygotowane ekstrakty z kory wykazywały wyraźne działanie antyproliferacyjne przeciwko ludzkim liniom komórek nowotworowych. Obecnie stosowane cztery linie komórkowe wykazywały podobną wrażliwość na ekstrakty i nie wykryto żadnych istotnych różnic pomiędzy siłą hamowania proliferacji badanych próbek

Hamowanie proliferacji ekstraktów z brzozy zastosowanych na 4 liniach komórek nowotworowych (A431, A2780, HeLa i MCF7).

Celem testu MTT było bezpośrednie porównanie ekstraktów i stwierdzenie, że wartości IC50 _dla wszystkich próbek mieszczą się w przedziale od 1 do 5 µg/ml. Dlatego też zasadnicze różnice w zawartości betuliny i kwasu betulinowego w ekstraktach nie znajdują odzwierciedlenia w działaniu antyproliferacyjnym. Przyczyna tej sprzeczności wykracza poza zakres niniejszej pracy, ale obecność w korze brzozy innych aktywnych związków naturalnych, w tym flawonoidów, wydaje się oczywistym wyjaśnieniem  .

Betulina jest znana jako związek przeciwzapalny [ ]. Wyciągi z kory brzozy badano w leczeniu rogowacenia słonecznego, wykazując istotne działanie lecznicze [  ]. Zewnętrzna kora brzozy zawiera jako główny związek betulinę, ale także inne triterpeny pentacykliczne [ ]. Skład ten może powodować różnice w aktywności biologicznej czystej betuliny i całkowitego ekstraktu z kory. Ważną interwencję w proces zapalny można powiązać z działaniem antyproliferacyjnym. Różne związki przeciwzapalne mogą zmniejszać częstość występowania nowotworów i rozwój przerzutów. Aspekt ten zauważono w różnych eksperymentalnych modelach zwierzęcych [ ].

W ciągu kilku godzin TPA może wywołać proces zapalny poprzez zwiększenie przepuszczalności naczyń, powodując obrzęk i obrzęk wewnątrz skóry właściwej [  ]. Zarówno betulina, jak i ekstrakt 1 pp i 3 pp powodują intensywną redukcję obrzęków. Indometacyna jest silnym lekiem przeciwzapalnym, stosowanym w naszych badaniach jako punkt odniesienia dla modelu obrzęku ucha. Ocena dawki indometacyny LD ₅₀ 50 mg/kg u myszy opiera się na 14-dniowej odpowiedzi dotyczącej śmiertelności. Dawka ta jest skorelowana z 1,25 mg indometacyny/25 mg myszy, czyli nieco powyżej dawki podawanej miejscowo. TPA – model ucha jest przydatny do badań przesiewowych nowych miejscowych związków przeciwzapalnych i ekstraktów roślinnych. Miejscowe zastosowanie TPA powoduje infiltrację komórek masowych, której towarzyszy uwalnianie mediatorów, które zwiększają przepuszczalność naczyń i sprzyjają napływowi neutrofilów [  ]. Miejscowe stosowanie TPA powoduje również wytwarzanie stresu oksydacyjnego, który może przyspieszyć miejscowe uszkodzenie [  ]. Związki hamujące enzymy COX lub LOX wykazały również hamowanie zapalenia ucha TPA [ ] i można je uważać za silne związki przeciwnowotworowe. Betulina jest porównywalna z indometacyną, a także analizowanymi ekstraktami z brzozy pod względem skuteczności; ekstrakty wykazują jednak najbardziej intensywny potencjał przeciwzapalny  ze względu na kumulację działania innych triterpenów, obecnych również w składzie ekstraktu, nawet w małych stężeniach (kwas betulinowy, lupeol itp.).

Próbki do badań: A. TPA, B. indometacyna i C. betulina. A. Tkanka nabłonkowa i chrząstkowa z głębokim i dużym obrzękiem (HE x 200) – zapalenie olejem krotonowym, B. Tkanka nabłonkowa chrząstkowa i mięśniowa z dyskretnym zapaleniem nabłonkowym (HE x 200), C. Tkanka nabłonkowa chrząstkowato-mięśniowa z dyskretny obrzęk, naciek zapalny podnabłonkowy i rzadkie przekrwienie naczyń (HE x 200) leczenie betuliną.

Wnioski

Doniesiono o nowym protokole ekstrakcji, który ujawnił wysoką zawartość betuliny w zewnętrznej korze brzozy. Produkty ekstrakcji szczegółowo scharakteryzowano za pomocą spektroskopii HPLC, NMR, Ramana i SERS. Połączenie procedury ekstrakcji przy użyciu rozpuszczalników i odpowiedniej temperatury doprowadziło do uzyskania produktu końcowego o bardzo wysokiej zawartości związków aktywnych, takich jak betulina. Betulina wraz z ekstraktami o wysokim stężeniu betuliny wykazywała in vitro silne działanie antyproliferacyjne i ważną aktywność in vivo , głównie działanie przeciwzapalne, co dodatkowo wzmacnia jej silne właściwości przeciwnowotworowe.

Metody

Materiał roślinny

Korę brzozy ( Betula pendula Roth, rodzina Betulaceae) zebrano w kwietniu 2010 r. z Ponoarele, Mehedinţi, Rumunia (źródło A) i z gór Aninei w Rumunii (źródło B). Materiał roślinny został uwierzytelniony przez Wydział Botaniczny Wydziału Farmacji Uniwersytetu Medycyny i Farmacji w Timisoarze w Rumunii, gdzie zdeponowano okazy voucherów (1120 i 1121). Materiał roślinny jest szarobiały i łuszczy się w poziome paski.

Ekstrakcja składników aktywnych

15 g produktu roślinnego z kory brzozy  umieszczono w gilzie z bibuły filtracyjnej w ekstraktorze Soxhleta, następnie ekstrahowano 2-propanolem lub etanolem (96% v/v), jak podano w tabeli . Stosowanymi odczynnikami były produkty handlowe (Reactivul Bucuresti) i stosowano je bez dalszego oczyszczania. Temperatury topnienia (mp) oznaczono na aparacie Böetius PHMK (Veb Analytik Dresden). Wszystkie ekstrakty standaryzowano i określano zawartość składników aktywnych.

Przygotowanie suchych ekstraktów

Po 6 godzinach ekstrakcji wszystkie kolby pozostawiono do ochłodzenia w temperaturze pokojowej (~25°C) na 24 godziny. W przypadku ekstraktów 2-propanolowych z obu źródeł A i B można zauważyć samoistne tworzenie się krystalicznych osadów (odpowiednio 1 pp i 3 pp), które oddzielono metodą filtracji próżniowej i przemyto zimną wodą destylowaną. Każdy osad następnie suszono w piecu w temperaturze 90°C przez 24 godziny (temperatura topnienia = 256–258°C odpowiednio dla 1 pp i 255–256°C dla 3 pp). Po ich usunięciu uzyskany roztwór zatężono do ok. 80 mL przy użyciu wyparki obrotowej (100 mmHg, 50°C), co doprowadziło do oddzielenia kremowych substancji stałych (odpowiednio 1 i 3) poprzez filtrację próżniową, przemyto zimną wodą, a następnie suszono w piecu w temperaturze 90°C przez 24 godz.

Ekstrakty etanolowe z obu źródeł A i B zatężono do ok. 80 mL przy użyciu wyparki obrotowej (100 mmHg, 50°C); powstałe kremowe ciała stałe (2 i 4) oddzielono przez filtrację próżniową i przemyto zimną wodą, następnie suszono w piecu w temperaturze 90°C przez 24 godziny.

Wysuszony ekstrakt zważono i obliczono plon na podstawie mokrej masy kory brzozy. Wydajność ekstrakcji wahała się od 7 do 10% w zależności od rozpuszczalnika do ekstrakcji, przy czym wydajność w propanolu była wyższa w porównaniu z etanolem.

Analiza HPLC

HPLC w połączeniu ze spektrometrem mas

Pompa binarna HP 1100 Series, odgazowujący online 1100 Agilent, automatyczny próbnik HP 1100 Series, termostat HP 1100 Series, spektrometr mas Agilent Ion Trap 1100 SL

Warunki pracy HPLC: Kolumna analityczna: Zorbax SB-C18 100 mm x 3,0 mm śr. wewn., 3,5 µm (Agilent), Filtr on-line 0,2 mikrona (Agilent). Faza ruchoma: elucja izokratyczna kwasem mrówkowym 0,4% (V/V) / metanol 14/86 (V/V). Przepływ: 1 ml/min, temperatura: 40°C. Objętość wtrysku: 2 µl

Wykrycie:

• • Betulina – MS – monitorowanie jonów m/z 425,6, odpowiadające protonowanemu produktowi odwodnienia betuliny [MH ₂ O] ⁺
• • Kwas betulinowy – MS – monitorowanie jonów m/z 439,6, odpowiadający produktowi odwodnienia protonowanego kwasu betulinowego [MH ₂ O] ⁺

Warunki pracy MS: Źródło jonów: APCI + (jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym). Tryb jonizacji: dodatni. Elektrorozpylanie: azot, ciśnienie 60 psi. Parownik: 400°C. Gaz suszący: azot, obciążenie 7 L/min, temperatura 300°C. Napięcie kapilarne: 2000 V. Tryb analizy: SIM-MS, m/z 425,6 (betulina) i 439,6 (kwas betulinowy)

Wszystkie operacje chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze otoczenia.

Standardy

Do oznaczania ilościowego zastosowano wzorce betuliny/kwasu betulinowego (Extrasynthese, Francja, odpowiednio seria 05112416 i seria 05112407).

Przetwarzanie próbek

10 ± 5 mg proszku odważono w 10 ml kolbie i rozpuszczono w mieszaninie acetonitryl/aceton 50/50. Przygotowano dwa rozcieńczenia: 1/1000 do analizy betuliny i 1/100 do analizy kwasu betulinowego.

Krzywą kalibracyjną dla betuliny i kwasu betulinowego zbudowano w zakresie stężeń odpowiednio 44,2-884 ng/ml i 39,5-790 ng/ml (Dodatkowy plik 5  Tabela S1 i Dodatkowy plik  : Tabela S2, Dodatkowy plik  : Rysunki S5 oraz plik dodatkowy : rysunek S6). Wszystkie roztwory przygotowano w mieszaninie metanol/woda 50/50.

Spektroskopia NMR

Widma węgla rejestrowano przy częstotliwości 150,86 MHz ¹³ C Larmora za pomocą spektrometru Bruker AVANCE-600, stosując standardową sekwencję impulsów CP/MAS [  ]. Częstotliwość wirowania próbki wynosiła ν _R  = 12 kHz, długość zastosowanego impulsu ¹ H 90° wynosiła 3,8 μs, a sygnał uzyskano przy dwuimpulsowym modulowaniu fazy (TPPM) [  ] Odsprzężenie ¹ H przy 70 kHz poprzez uśrednianie 10 000 skanów z opóźnieniem ładowania 3 s. Transfer CP zoptymalizowano dla pierwszego warunku dopasowania Hartmanna – Hahna (ν _1C  = ν _1H – ν _R ) i zastosowano impuls kontaktowy o długości 1,5 ms. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Przesunięcia chemiczne węgla-13 wyrażane są w częściach na milion (ppm) i kalibrowane w odniesieniu do tetrametylosilanu.

Spektroskopia Ramana i SERS

Widma FT-Raman ekstraktów rejestrowano przy użyciu spektrometru Brucker Equinox 55 ze zintegrowanym modułem światłowodowym modułu Ramana FRA 106 s sprzężonym z mikroskopem Ramanscope II Raman. Do wzbudzenia Ramana zastosowano linię 1064 nm lasera Nd:YAG, a do detekcji zastosowano detektor Ge w temperaturze ciekłego azotu.

Dodatkowo zastosowano powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie Ramana (SERS), aby uzyskać wgląd w właściwości adsorpcyjne ekstraktów. Jako substrat SERS zastosowano koloidalne nanocząstki Ag o zmniejszonej zawartości cytrynianu. Zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy (LSPR) takich nanocząstek wykazuje pasmo absorpcji elektronów przy 410 nm. 3,8 mg ekstraktu 1 pp rozpuszczono w 2 ml etanolu i poddano sonikacji przez 10 minut. Po dodaniu do nanocząstek Ag śladowej ilości (około 10 ul) roztworu ekstraktu etanolowego, koloid Ag zmienia kolor z szaro-żółtego na ciemny, co sugeruje komplementarną agregację w obecności zaadsorbowanych związków. W konsekwencji ich LSPR przesuwa się na większą długość fali, dlatego wzbudzenie linii lasera 632 nm mieści się w stanie rezonansowym tzw. pasma przenoszenia ładunku adsorbatu Ag i można uzyskać wzmocniony sygnał Ramana kompleksu Ag-betulina. Widma SERS rejestrowano przy użyciu spektrometru Ramana DeltaNU wyposażonego w laser He-Ne emitujący długość fali 632,8 nm. Moc lasera wynosiła 40 mW, a rozdzielczość widmowa 10 cm ^-1 .

Oznaczanie działania antyproliferacyjnego

Działanie hamujące wzrost mierzono in vitro na czterech złośliwych ludzkich liniach komórkowych (ECACC, Salisbury, Wielka Brytania): A431 (rak naskórkowy skóry), A2780 (rak jajnika), HeLa (gruczolakorak szyjki macicy) i MCF7 (gruczolakorak piersi) za pomocą testu MTT [ ]. Komórki utrzymywano w minimalnej pożywce niezbędnej (Sigma-Aldrich) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% aminokwasami egzogennymi i mieszaniną antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. W skrócie, prawie zlewające się komórki nowotworowe wysiano na 96-dołkową mikropłytkę (5000 komórek/dołek) i po nocy dodano nową pożywkę (200 µl) zawierającą testowane ekstrakty. Najwyższe stężenie wynosiło 30 µg/ml. Po inkubacji przez 72 godziny w temperaturze 37°C w nawilżonym powietrzu zawierającym 5% CO2 _, żywe komórki oznaczono przez dodanie 5 mg/ml roztworu MTT (20 µl). MTT został przekształcony przez nienaruszoną reduktazę mitochondrialną i wytrącony w postaci niebieskich kryształów podczas 4-godzinnego okresu kontaktu. Następnie pożywkę usunięto, a wytrącone kryształy formazanu rozpuszczono w DMSO (100 µl) podczas 60-minutowego wytrząsania w temperaturze 25°C. Na koniec oznaczono zredukowany MTT przy 545 nm, stosując czytnik mikropłytek; jako kontrole wykorzystano studzienki z nietraktowanymi komórkami. Roztwory podstawowe badanych substancji (10 mg/ml) przygotowano z DMSO. Najwyższa zawartość DMSO w pożywce nie miała istotnego wpływu na proliferację komórek.

Badania na zwierzętach

Badania na zwierzętach przeprowadzono na samicach myszy C57BL/6 J w wieku 8 tygodni. Myszy zakupiono od Charles River (Sulzfeld, Niemcy). Protokół pracy był zgodny ze wszystkimi zasadami NIAH – Narodowego Instytutu Zdrowia Zwierząt: zwierzęta podczas doświadczenia trzymano w standardowych warunkach: 12-godzinny cykl światło-ciemność, jedzenie i woda do woli, temperatura 24°C, wilgotność powyżej 55%. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną UMFVBT. Liczba myszy wziętych do badania wynosiła dwadzieścia cztery i została podzielona na sześć grup w następujący sposób:

• • grupa A: myszy, którym podano do ucha TPA w acetonie
• • grupa B: myszy, którym podano do ucha TPA w acetonie, a następnie po 30 minutach jako kontrolę podano indometacynę
• • grupa C: myszy, którym podano do ucha TPA w acetonie, a następnie po 30 minutach betulinę
• • grupa D: myszy, którym podano do ucha TPA w acetonie, a następnie po 30 minutach 1 pp ekstraktu
• • myszy z grupy E, którym podano do ucha TPA w acetonie, a następnie po 30 minutach 3 pp ekstraktu
• • grupa I: ślepa (niepoddana obróbce)

Zapalenie obu uszu każdej myszy wywołano poprzez miejscowe nałożenie 2 µg TPA rozpuszczonego w 20 µl acetonu zarówno na wewnętrzną, jak i zewnętrzną powierzchnię ucha. Trzydzieści minut po zastosowaniu TPA wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnię każdego ucha potraktowano 2 mg betuliny lub równoważną ilością ekstraktu z brzozy. Tę samą ilość indometacyny, 2 mg, zastosowano jako kontrolę pozytywną. Rozpuszczalnikiem był aceton:DMSO w stosunku molowym 9:1, a podana ilość wynosiła 0,1 ml [  ]. Myszy zabijano po 4 godzinach przez zwichnięcie odcinka szyjnego i pobierano uszy. Uszy natychmiast zważono i uznano za masę mokrą. Uszy suszono przez 24 godziny w suchym piecu, ponownie ważono i masę określano jako suchą masę. Zawartość wody w skórze obliczono odejmując suchą masę od mokrej masy, a następnie dzieląc przez mokrą masę. Wyraża się go jako H ₂ O/mg suchej masy [ ].

Do analizy histologicznej próbki tkanek (skóry) utrwalono w 10% roztworze formaliny, zatopiono w parafinie i pocięto na grubość 4 mikronów. Na koniec, po usunięciu parafiny, próbki wybarwiono H&E (hematoksyliną-eozyną) i poddano analizie mikroskopowej.

Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach i analizowano statystycznie za pomocą jednokierunkowej ANOVA i przedstawiono jako średnią ± SEM; Za istotne uznano p < 0,01.

Wkład autorów

Procedury ekstrakcji przeprowadziły CS, IL i OV. CS, MA, MM i SCP przeprowadziły analizę fizykochemiczną ekstraktów. CD, AG i IZ przeprowadziły badania biologiczne. Wszyscy autorzy uczestniczyli w projektowaniu i koordynacji artykułu oraz pomogli w przygotowaniu manuskryptu. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Bibliografia

1. Mullauer FB, Kessler JH, Medema JP: Betulina jest silnym środkiem przeciwnowotworowym wzmocnionym cholesterolem. PLOS JEDEN. 2009, 4 (4): e1-10.1371/journal.pone.0005361.

2. Şoica C, Dehelean C, Ordodi V, Antal D, Vlaia V: Kompleksowanie z hydroksypropilgamma cyklodekstryną ekstraktu z brzozy. Charakterystyka fizykochemiczna ich produktów binarnych. Wielebny Chim. 2008, 59: 678-681.
3. Rajendran P, Jaggy M, Singh MK, Mukherjee R, Burman AC: Farmakologiczna ocena pochodnych kwasu betulinowego modyfikowanego C-3 o silnym działaniu przeciwnowotworowym. Inwestuj w nowe leki. 2008, 26: 25-34. 10.1007/s10637-007-9081-4.
4. Hänsel R, Keller K, Rimpler H, Schneider G: Drogen AD: Betula. 1992, Berlin: Springer Verlag